传统观念中，无脊椎动物外骨骼常被视为“无生命的石头”，而脊椎动物骨骼因具有终身造血功能，被视为“活的器官”，成为脊椎动物特有的重要演化创新。这一观点常出现在教科书中。

　　然而，中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室包振民院士和王师教授团队，历时9年在动物骨骼造血研究领域获得的最新发现，却颠覆了这一观点。近日，这项成果发表于《科学进展》。

　　“我们在国际上首次揭示了无脊椎动物骨骼中普遍存在造血干细胞巢，解开了5亿多年前贝壳的生命奥秘，颠覆了骨骼造血为脊椎动物特有演化创新的传统观念，为理解动物造血系统起源演化提供了全新视角，也为海洋生物干细胞研究开辟了新方向和新范式。”论文通讯作者之一王师对《中国科学报》说。

　　从一次实验“意外”到颠覆性发现

　　软体动物，俗称贝类，是海洋中最大的动物门类，也是寒武纪早期起源的主要矿化骨骼代表性动物类群之一。研究发现，贝壳呈现出许多令人费解的生物学特性，与脊椎动物骨骼存在关联性，却始终难以用传统认知合理解释。

　　寒武纪为何出现有壳类生物大爆发？贝壳是否为传统认知中没有生命的“石头”？……这些生物学界的未解之谜，是生命演化史上的“悬案”。

　　“谁会想到，我们团队这项研究的肇端，竟是9年前一次实验中的意外发现。”王师说。

　　2016年，团队尝试对新鲜贝壳进行核酸提取时，发现了一个匪夷所思的现象：样本中不仅检测到DNA，还有活细胞的指示物——RNA分子。这一结果之所以“意外”，一是因为RNA分子极不稳定，在活细胞外会快速降解，二是因为贝壳一直被认为是“无生命的石头”，不该有RNA残留。因此，团队最初认为这是贝壳内表面软体组织未清理干净、样本受到污染所致。但在多次对贝壳样本进行彻底清理后，他们仍能检测到RNA分子的存在。

　　这一“意外”的现象让团队意识到，贝壳里可能存在活细胞。

　　“这意味着过去被认为是‘无生命的石头’的贝壳，实际上是一个‘活的器官’。”回想起当时的情景，王师仍兴奋不已，“这是学界观念的颠覆性更新，也意味着我们找到了侦破这起5亿多年前‘悬案’的关键突破口。”

　　不断发现、解决问题

　　“已经记不清有多少天，我们团队师生通宵鏖战了。”论文作者之一、中国海洋大学副教授连姗姗说，“科研攻关的过程，其实就是不断发现问题、分析问题和解决问题的过程。”

　　要证实贝壳里存在活细胞，团队面临的第一个难题就是从坚硬的贝壳中稳定、有效地提取RNA。由于传统软组织研磨方式并不适用，他们只能先将贝壳在液氮中速冻，再在研钵中将其手动研磨成粉。这是进行RNA提取实验的先决条件，也是一项耗时费力的体力活。

　　团队成员、中国海洋大学博士生胡乃娜和硕士生刘思诺两人，最开始常常要连续几天在实验室重复这一工作。“磨一上午，手就起泡了，而且效率比较低，做一次RNA提取实验往往要耗费几天时间来做准备。”胡乃娜说，这说明做科研不只要有扎实的学术基础，还要有埋头苦干的韧劲。后来团队引入了研磨仪，才解决了稳定提取RNA的问题。

　　接下来，对贝壳内细胞进行直接观察成为新挑战，这需要对高度钙化的贝壳进行脱钙处理。然而，针对贝壳优化的脱钙液并无现成配方，需要团队自行摸索。

　　团队花了近半年时间，尝试去除贝壳表面坚硬的碳酸钙层，暴露内部的有机质层。这项工作完成后，团队又开始反复优化固定和染色方法，以便在显微镜下观察细胞分布。

　　“最初，染色效果很不理想。在进行了若干次尝试后，我们最终选择了边脱钙边固定的方式，尽可能保持细胞的完整形态。”连姗姗说，团队最后成功脱除了贝壳的部分钙质层，并通过染色清晰观察到了细胞的存在和分布。

　　他们发现，贝壳内的确存在活细胞。新的问题也随之而来：这些活细胞属于什么类型，又有什么功能？

　　单细胞测序技术给团队提供了很大帮助，也提出了更大挑战。“该实验的关键难点在于，单细胞测序技术通常要求对活细胞进行分析。仅解决这一问题，团队就耗费了近一年时间。”连姗姗说，后来团队摸索出了相对直接的方法，一是分析贝壳内偏好表达的胶原类型；二是短时间内将贝壳物理破碎成小块，这样能显著加快脱钙速度。“这一过程非常考验实验者操作的流畅度，必须在最短时间内完成上述操作，以确保细胞的活性。任何一步出现问题，就得从头再来。”

　　最终，团队成功建立了适用于无脊椎动物外骨骼的干细胞研究体系，并通过多组学遗传解析、细胞体外培养和诱导分化、活体动物细胞示踪和功能验证等系统性证据，揭示了贝壳内存在造血干细胞巢。

　　研究显示，贝壳内存在高丰度的造血干细胞，比例高达40%~60%；贝壳造血谱系展现出许多与脊椎动物相似的生物学特征；贝类造血干细胞除具有造血功能外，还具有生物矿化功能；动物界主要类群的矿化骨骼中均具有潜在的造血干细胞巢。研究还揭示了动物祖先造血干细胞核心调控基因集。基于此，研究团队提出了“骨骼干细胞巢的重大演化创新为寒武纪动物大爆发的重要驱动力”的新理论学说。

　　热爱与坚守才能走得更长远

　　“‘无脊椎动物骨骼内普遍存在造血干细胞巢’的原创性发现，是迄今国际上首次发现存在跨动物界保守的普适性干细胞巢，也是生命科学领域的重要认知突破，颠覆了骨骼造血为脊椎动物特有演化创新的传统观念，解答了长期困扰学术界的无脊椎动物造血干细胞来源之谜……”

　　论文发表后，第一时间便被选为期刊网站主页的3篇亮点文章之一，并被ScienceAdviser予以重点推介。对于成果，王师说：“这归功于团队全体成员的齐心协力与不懈奋斗。”

　　“科研之路充满了未知和挑战，做科研要坚持、坚守和坚定。”这是连姗姗的深切体会。

　　胡乃娜2016年进入实验室，她笑称9年多来自己与项目“共生”。“有长达一两年的时间，我处于反复尝试却难以获得理想结果的循环中，这是对我的巨大考验。所幸，我坚持了下来。”胡乃娜感慨道，“我知道周围不少同学和我一样，深夜还坚守在显微镜前，心无旁骛地钻研。这都是出自对科学的热爱。”

　　目前，团队已启动“探壳计划”，将研究目标从最初9个物种扩展到近50个，涵盖整个动物界的主要动物骨骼类群和完整进化链条，以期重塑对无脊椎动物造血系统的认知，为理解动物造血与矿化骨骼的宏观演化提供全新理论框架。

　　“我们想以更宏观的研究视角确认这一发现的普遍性，更想探索无脊椎动物类群骨骼干细胞高丰度的维持机制，为人类再生医学领域干细胞研究或治疗策略研发提供重要启示。”王师说。（记者 廖洋 通讯员 金松）

　　相关论文信息：

　　https://doi.org/10.1126/sciadv.adw0958